Білки - хімічна енциклопедія

Відео: Будова білка. Рівні організації білкової молекули

БІЛКИ

Відео: Біохімія. Урок 3. Білки. Структура і властивості. застосування білків

БІЛКИ. високомол. прир. полімери. побудовані із залишків амінокислот. з`єднаних амідній (пептидного) зв`язком-СО-NH-. Кожен білок характеризується специфічний. амінокислотною послідовністю та індивідуальної просторів, структурою (конформацией). На частку білків припадає не менше 50% сухої маси орг. соед. тваринної клітини. Функціонування білків лежить в основі найважливіших процесів життєдіяльності організму. Обмін в-в (травлення. Дихання і ін.), М`язове скорочення, нервова провідність і життя клітини в цілому нерозривно пов`язані з активністю ферментів - високоспеціфічен. каталізаторів биохим. р-ций, є білками. Основу кісткової і сполучної тканин. вовни, рогових утворень складають структурні білки (див. напр. Колаген). Вони ж формують кістяк клітинних органел (мітохондрій. Мембран і ін.). Розбіжність хромосом при поділі клітини. рух джгутиків, робота м`язів тварин і людини здійснюються за єдиним механізмом при посередництві білків скоротливої системи (див. напр. Актин. Міозин). Важливу групу складають регуляторні білки. контролюючі біосинтез білків і нуклеїнових к-т. До регуляторних білків відносяться також пептидно-білкові гормони. к-які секретуються ендокринними залозами. Інформація про стан зовн. середовища, разл. регуляторні сигнали (в т. ч. гормональні) сприймаються клітиною з допомогою спец. рецепторних білків. розміщених на зовнішньої пов-сті плазматіч. мембрани. Ці білки відіграють важливу роль у передачі нервового збудження і в орієнтованому русі клітини (хемотаксисі). В активному транспорті іонів. ліпідів. Сахаров і амінокислот через біол. мембрани беруть участь транспортні білки. або білки-переносники. До останніх відносяться також гемоглобін та міоглобін. здійснюють перенесення кисню. Перетворення і утилізація енергії, що надходить в організм з харчуванням, а також енергії сонячного випромінювання відбуваються за участю білків біоенергетіч. системи (напр. родопсин. цитохроми). Велике значення мають харчові і запасні білки (див. Напр. Казеїн. Проламіни), які відіграють важливу роль у розвитку і функціонуванні організмів. Захисні системи вищих організмів формуються захисними білками, до яких відносяться імуноглобуліни (відповідальні за імунітет), білки комплементу (відповідальні за лізис чужорідних клітин і активацію іммунологіч. Ф-ції), білки системи згортання крові (див. Напр. Тромбин. Фібрин) і противірусний білок інтерферон.

За складом білки ділять на прості, що складаються тільки з амінокислотних залишків, і складні. Складні можуть включати іони металу (Металопротеїни) або пігмент (хромопротеїди), утворювати міцні комплекси з ліпідами (ліпопротеїни), нуклеїновими к-тами (нуклеопротеїни), а також ковалентно пов`язувати залишок фосфорної к-ти (фосфопротеіди), вуглеводу (глікопротеїни) або нуклеїнової к-ти (геноми деяких вірусів). Відповідно до форми молекул білки поділяють на глобулярні і фібрилярні. Молекули перших згорнуті в компактні глобули сферич. або еліпсоїдної форми, молекули друге утворюють довгі волокна (фібрили) і високоасімметрічни. Більшість глобулярних білків. на відміну від фібрилярних, розчинні у воді. Особливу групу складають мембранні (амфіпатіческіе) білки, що характеризуються нерівномірним розподілом гідрофільних і гідрофобних (ліпофільних) ділянок в молекулі. занурена в біол. мембрану частина глобули складається переважно. з ліпофільних амінокислотних залишків, а виступає з мембрани - з гідрофільних.

Історична довідка. Перші роботи по виділенню і вивчення білкових препаратів були виконані ще в 18 ст. проте в той період дослідження білків носили описовий характер. У поч. 19 в. були зроблені перші аналізи елементного складу білків (Ж. Л. Гей-Люссак, Л. Ж. Тенар, 1810), що поклали початок систематичному. аналіт. дослідженням, в результаті яких брало було встановлено, що всі білкові в-ва близькі не тільки по зовн. ознаками і св-вам, але і по елементного складу. Важливе наслідок цих робіт - створення першої теорії будови білкових в-в (Г.Я. Мульдер, 1836), згідно якої всі білки містять загальний гіпотетічен. радикал - "протеїн", що має емпіріч. ф-лу C₄₀ H₆₂ N₁₀ O₁₂ і пов`язаний в разл. пропорціях з атомами сірки і фосфору. Отримавши спочатку загальне визнання, ця теорія привернула інтерес до аналіт. дослідженням білків, вдосконалення препаративних методів білкової хімії. У цей період були розроблені найпростіші прийоми виділення білків шляхом екстракції розчинами нейтральних солей і осадження. отримані перші кристалічні. білки (гемоглобін. нек-риє ростить. білки), для аналізу білків стали використовувати кислотний і лужний гідроліз.

Створення теорії протеїну збіглося за часом з формуванням уявлень про функції білків в організмі. У 1835 Й.Я. Бёрцедіус висловив ідею про найважливішу ф-ції білків - биокаталитических. Незабаром були відкриті перші протеолітіч. ферменти - пепсин (Т. Шмнн._1836) і трипсин (Л. Корвізар, 1856). Відкриття протеаз стимулювало інтерес біохіміків до фізіології травлення. а отже, і до продуктів перетравлення білків. До середини. 19 в. було показано, що під дією протеолітіч. ферментів білки розпадаються на близькі по св-вам фрагменти, які отримали назв. пептонов (К. Леман, 1850).

Важлива подія у вивченні білків - виділення з білкового гідролізату амінокислоти гліцину (А. Браконно, 1820). До кін. 19 в. було вивчено більшість амінокислот. що входять до складу білків, синтезований аланін (А. Штреккер, 1850). У 1894 А. Косеел` висловив ідею про те, що осн. структурними елементами білків є амінокислоти.

У поч. 20 в. значить. внесок у вивчення білків був внесений Е. Фішером. вперше застосував для цього методи орг. хімії. Шляхом зустрічного синтезу Е. Фішер довів, що білки побудовані із залишківамінокислот. пов`язаних амідній (пептидного) зв`язком. Він також виконав перші амінокислотні аналізи білків, дав правильне пояснення протеолізу.

У 20-40-і рр. отримали розвиток фіз.-хім. методи аналізу білків. Седиментаційним і дифузійними методами були визначені мовляв. маси багатьох білків, отримані дані про сферич. формі молекул глобулярних білків (Т. Сведберг, 1926), виконані перші рентгеноструктурні аналізи амінокислот і пептидів (Дж. Д. Бернал, 1931), розроблені хроматографіч. методи аналізу (А. Мартін, Р. Сінг, 1944). Істотно розширилися уявлення про функціональну роль білків: був виділений перший білковий гормон - інсулін (Ф. Бантінг, Ч. Г. Бест, 1922), антитіла були ідентифіковані як фракціяглобулінів (1939) і тим самим виявлена нова ф-ція білків - захисна. Важливим етапом стало відкриття ферментативної ф-ції м`язового міозину (В. А. Енгельгардт, М.Н.Любімова, 1939) і отримання перших кристалічної. ферментів (уреази-Дж.Б. Салшер, 1926- пепсину - Дж.X. Нортроп, 1929- лізоциму - Е. П. Абрахам, Р. Робінсон, 1937).

У поч. 50-х рр. була висунута ідея про три рівні організації білкових молекул (К. У. Ліндерстрём-Ланг, 1952) - первинної, вторинної та третинної структурах. Визначено первинні структури інсуліну (Ф. Сенгер, 1953) і рибонуклеази (К. Анфінсен, С. Мур, К. Хёрс, У. Стайн, 1960). За даними рентгеноструктурного аналізу були побудовані тривимірні моделі міоглобіну (Дж. Кендрю, 1958) і гемоглобіну (М, Перутц, 1958) і, т. Обр. доведено існування в білках вторинної і третинної структур, в т. ч. спіралі. передбаченої Л. Допінгом і Р. Корі в 1949-51.

У 60-і рр. в хімії білків інтенсивно розвивалося синтетичні. напрямок: були синтезовані інсулін (X. Цан, 1963, П. Кадояніс, 1964, Ю. Ван та ін. 1965) і рибонуклеаза А (Б. Мерріфідд, 1969). Подальший розвиток отримали аналіт. методи: став широко використовуватися автоматичним. амінокислотний аналізатор, створений С. Муром і У. Стайном в 1958, істотно модифіковані хроматографіч. методи, до високого ступеня досконалості доведений рентгеноструктурний аналіз, сконструйований автоматичним. прилад для визначення послідовності амінокислотних залишків в білках - секвенатор (П. Едман, Г. Бегг, 1967). Завдяки створенню міцної методич. бази стало можливим проводити широкі дослідження амінокислотноїпослідовності білків. У ці роки була визначена структура дек. сотень порівняно невеликих білків (до 300 амінокислотних залишків в одного ланцюга), отриманих з найбільш разл. джерел як тварини, так і ростить. бактеріального, вірусного та ін. походження. Серед них - протеолітіч. ферменти (трипсин. хімотрипсин. субтілізін. карбоксипептидази), міоглобіну. гемоглобіни. цитохроми. лізоцими. імуноглобуліни. гістони. нейротоксини, білки оболонок вірусів. білково-пептидні гормони та ін. В результаті були створені передумови для вирішення актуальних проблем ензимології, імунології, ендокринології та ін. областей фіз.-хім. біології.

У 70-80-і рр. наиб. прогрес був досягнутий при вивченні білків - регуляторів матричного синтезу біополімерів (в т.ч. білків рибосом), скорочувальних, транспортних і захисних білків, ряду мембранних білків (в т. ч. білків біоенергетіч. систем), рецепторних білків. Велика увага приділялася подальшому вдосконаленню методів аналізу білків. Значно підвищена чутливість автоматичним. аналізу амінокислотної послідовності білків (Б. Вітман-Лібольд, Л. Худ). Широке застосування знайшли нові методи розділення білків і пептидів (рідинна хроматографія високого тиску. Біоспеціфіч. Хроматографія). У зв`язку з розробкою ефективних методів аналізу нуклеотидної послідовності ДНК (А. Максам і У. Гілберт, Ф. Сенгер) стало можливим використовувати отриману при такому аналізі інформацію і при визначенні первинної структури білків. В результаті встановлено структуру ряду білків, доступних в мізерно малих кол-вах (інтерферон. Ацетилхолінових рецепторів), а також білків великий мовляв. маси (фактор елонгації G, глікогенфосфорилази,галактозидаза, колаген, ісубодиниці РНК-полімерази. містять соотв. 701, 841, 1021, 1028, +1342 і +1407 амінокислотних залишків). Успіхи структурного аналізу дозволили впритул приступити до визначення просторів, організації і молекулярних механізмів функціонування надмолекулярних комплексів, в т.ч. рибосом, хроматину (нуклеосом), мітохондрій. фагів і вірусів. Істот, результати отримані в ці роки радянськими вченими: визначена первинна структура аспартатамінотрансферази (1972), бактериородопсина (1978), тваринного родопсина (1982), деяких рибосомних білків, фактора елонгації G (1982), найважливішого ферменту-РНК-полімерази (1976 -82), нейротоксинов і ін.

Білкова молекула може складатися з однієї або дек. ланцюгів, що містять від 50 до дек. сотень (іноді - більше тисячі) амінокислотних залишків. Молекули. містять менше 50 залишків, часто відносять до пептидів. До складу мн. молекул входять залишки цистину. дисульфідні зв`язки яких брало ковалентно пов`язують ділянки однієї або дек. ланцюгів.

У нативному стані макромолекули білків мають специфічний. конформацией. Характерна для даного білка конформація визначається послідовністю амінокислотних залишків і стабілізується водневими зв`язками між пептидними і бічними групами амінокислотних залишків, а також гідрофобними і електростатіч. взаємодіями. Великий вплив на конформацію надають взаємодій. білків з компонентами середовища (вода. ліпіди та ін.), в якій вони функціонують.

Розрізняють чотири рівні організації білкових молекул. Послідовність амінокислотних залишків у поліпептидному ланцюзі зв. первинною структурою. Всі білки розрізняються по первинній структуре- потенційно можливе їх число практично необмежена. Термін "вторинна структура" відноситься до типу укладання поліпептидних ланцюгів. наиб. часто зустрічаються типи-права спіраль іструктура. Перша характеризується планарна пептидного групи- водневі зв`язку між СО-і NH-групами пептидного ланцюга замикають цикли з 13 атомів (рис. 1). На 1 витокспіралі доводиться 3,6 залишку амінокислот. крок спіралі -0,544 нм. Значно менш енергетично вигідні праві 3₁₀ - іспіралі. містять соотв. 3 і 4,4 амінокислотних залишку на 1 виток, а також 10 і 16 атомів в циклах, утворених водневими зв`язками. 3₁₀ -Спіралі зустрічаються порівняно рідко і утворюють тільки дуже короткі ділянки, к-які зазвичай розташовуються на кінцяхспіралей. Передбачені теоретично правіспіралі. а також ліві 3₁₀ - іспіралі в білках не виявлені.

В разіструктури, або структури складчастого листа, поліпептидні ланцюги розтягнуті, укладені паралельно один одному і пов`язані між собою водневими зв`язками. Остов ланцюга не лежить в одній площині, а внаслідок невеликих вигинів привуглецевих атомах утворює злегка хвилястий шар. Бічні групи розташовуються перпендикулярно площині шару. У білках виявлено два видиструктури: з паралельним і антипаралельними напрямками ланцюгів (рис. 2). Окремий випадокструктури-вигин, що забезпечує поворот пептидного ланцюга на кут ок. 180 ° на протязі відрізка, що містить 4 амінокислотних остатка- 1-й і 4-й залишки з`єднані водневим зв`язком. відносний вмістспіральних ділянок і структур може широко варіювати. Існують білки з переважаннямспіралей (бл. 75% в миоглобине і гемоглобіні), тоді як осн. тип структури багатьох фібрилярних білків, в т.ч. фиброина шовку і кератину волосся, -структура. У багатьох білків зміст іструктурних ділянок незначно, однак і в цих випадках поліпептидні ланцюга укладаються в просторі строго певним, характерним для кожного білка чином.

Під третинної структури білків розуміють розташування його поліпептидного ланцюга в просторі. Істот. вплив на формування третинної структури надають розмір, форма і полярність амінокислотних залишків. У молекулах глобулярних білків велика частина гідрофобних залишків прихована всередині глобули, а полярні угруповання розташовуються на її пов-сті в гідратованому стані. Однак ситуація не завжди настільки проста. Зв`язування білка з ін. Молекулами. напр. ферменту з його субстратом або коферментом. майже завжди здійснюється за допомогою невеликого гидрофобного ділянки на пов-сті глобули. Область контакту мембранних білків з ліпідами формується переважно. гідрофобними залишками. Третинна структура багатьох білків складається з дек. компактних глобул, наз. доменами (рис. 3). Поміж себе домени зазвичай бувають пов`язані "тонкими перемичками" - витягнутими поліпептидними ланцюгами. Пептидні зв`язку. розташовані в цих ланцюгах, розщеплюються в першу чергу при обробці білків протеолітіч. ферментами. тоді як окремі домени м. б. досить стійкі до протеолізу.

Мал. 2. Схематичне зображенняструктур: зліва - антипаралельними, праворуч - паралельний складчастий лист.

Мал. 3. Схематичне зображення тривимірної структури малатде-гідрогенази. ділянкиспіралей (від до) іструктур (від до) Представлені соотв. у вигляді прямокутників і прямих ліній зі стрілками. Структура складається з двох чітко помітних глобулярних областей (доменів). Ділянка поліпептидного ланцюга, що з`єднує домени між собою, показаний точкової лінією.

Термін "четвертичная структура" відноситься до макромолекулам. до складу яких брало входить дек. поліпептидних ланцюгів (субодиниць), які пов`язані між собою ковалентно. Така структура відображає спосіб об`єднання і розташування цих субодиниць в просторі. Між собою окремі субодиниці з`єднуються водневими, іонними, гідрофобними і ін. Зв`язками. Зміна рН і іонної сили розчину, підвищення т-ри або обробка детергентами зазвичай призводять до дисоціації макромолекули на субодиниці. Цей процес звернемо: при усуненні факторів, що викликають дисоціацію. може відбуватися мимовільна реконструкція вихідної четвертичной структури. Явище носить загальний характер: за принципом самозборки функціонують багато біол. структури. Здатність до самосборке властива і окремими фрагментами білків - доменів. Більш глибокі зміни конформації білків з порушенням третинної структури зв. денатурацією.

Властивості. Фіз.-хім. св-ва білків визначаються їх високомол. природою, компактністю укладання поліпептидних ланцюгів і взаємним розташуванням залишків амінокислот. Мовляв. маса варіює від 5 тис. до 1 млн. а константи седиментації - від 1 до 20 (і вище). Середній уд. обсяг білкових молекул - 0,70-0,75 см 3 / г, а константи дифузії - 10 6 -10 8 см 2 / с. Максимум поглинання білків в УФ-області спектра, обумовлений наявністю ароматичних. амінокислот. знаходиться поблизу 280 ім. Порушення електронів атома азоту пептидної групи викликає різке збільшення поглинання при 185-240 нм. В ІК-області спектра білки поглинають за рахунок СО і NH-rpyпп при 1600 і 3100-3300 см -1.

У розчинах білки амфотерни. Ізоелектрічен. точки білків можуть мати значення від lt; 1,0 (у пепсину) до 10,6 (у цитохрому с) і вище. Бічні групи амінокислотних залишків здатні вступати в багато р-ції. Білки дають ряд кольорових р-ций, обумовлених наявністю певних амінокислотних залишків або хім. угруповань. До найважливіших з них відносяться: биуретовая реакція (пептидні зв`язку), ксантопротеїнова реакція (ароматич. Ядра залишків тирозину. Триптофану. Фенілаланіну), Адамкевича реакція (індольне кільце триптофану), Міл лона реакція (фенольний радикал тирозину), Паулі реакція (імідазольного кільце гістидину ), Сакагучи реакція (гуанідинового група аргініну) і Нінгідринова реакція (аминогруппа).

Виділення. Один з перших етапів виділення білків - отримання відповідних органел (рибосом, мітохондрій. Ядер, цітоплазматіч. Мембрани) за допомогою диференціального центрифугування. Далі білки переводять в розчинний стан шляхом екстракції буферними розчинами солей і детергентів. іноді - неполярними р-телеглядачам. Потім застосовують фракційне осадження неорг. солями [зазвичай (NH₄ )₂ SO₄ ], Етанолом. ацетоном або шляхом зміни рН, іонної сили, т-ри. Для запобігання денатурації роботу проводять при пониж. т-ре (бл. 4 ° С) - з метою виключення протеолізу використовують інгібітори протеаз. нек-риє білки стабілізують поліол, напр. гліцерином. Подальшу очистку проводять за схемами, спеціально розробленим для окремих білків або групи гомологічних білків: наиб. поширені методи поділу-гель-проникаюча хроматографія. ионообменная і адсорбції. хроматографія - ефективні методи-рідинна хроматографія високого дозволу і афінна хроматографія.

Критерій чистоти білків - гомогенність при електрофорезі. хроматографії та ультрацентріфугірованіі. Одноланцюговий білок повинен бути гомогенним при N- і С-кінцевому аналізі (див. Нижче). Домішка супутніх ферментів визначають за допомогою специфічний. субстратів - високу чутливість мають іммунохім. методи (зазвичай до 10 -3 мкг / мл домішкового антигену).

Методи дослідження первинної структури. Знання первинної структури білка-основа для визначення його вторинної і третинної структур, з`ясування розташування функц. груп в активному центрі білка і побудови моделі його функціонування. Дослідження первинної структури мутантних білків дозволяє на молекулярному рівні характеризувати відмінності між штамами мікроорганізмів. фагів і вірусів. з`ясовувати молекулярні причини генетич. хвороб. Дані по первинній структурі використовують при встановленні і перевірці таксономіч. взаємовідносин між разл. видами живих організмів. побудові фило-генетич. древа і аналізі ходу біол. еволюції.

Для визначення амінокислотної послідовності білка перш за все поділяють його поліпептидні ланцюга (якщо макромолекула складається з дек. Ланцюгів). Потім визначають амінокислотний склад ланцюгів, N- і С-кінцеві амінокислотні залишки і амінокислотні послідовності. Поліпептидні ланцюги піддають специфічний. розщепленню протеолітіч. ферментами або хім. реагентами. Суміш утворилися фрагментів поділяють і для кожного з них визначають амінокислотний склад і амінокислотну послідовність. При необхідності великі фрагменти додатково розщеплюють до.-л. способом на більш дрібні. Порядок розташування фрагментів з`ясовують шляхом розщеплення молекули білка по ін. Зв`язків і аналізу утворюються при цьому "перекриваються" фрагментів.

Аналіз амінокислотного складу включає повний гідроліз досліджуваного білка або пептиду і кількостей. визначення всіх амінокислот в гідролізаті. Для гідролізу зазвичай використовують 5,7 н. водний розчин НС1, а при аналізі вмісту триптофану - 4 н. метансульфонової к-ту, що містить 0,2% 3- (2-аміноетил) індолу. або кип`ятіння з лугом. Кількостей. визначення амінокислот в гідролізаті проводять за допомогою амінокислотного аналізатора. У більшості таких приладів суміш амінокислот поділяють на іонообмінних колонках, детекцию здійснюють спектрофотометрически по р-ції з нингидрином або Флуоріметріческій з використанням флуорескаміна або о-фталевого діальдегіду. В останньому випадку можна аналізувати до 0,1-0,05 нмоль амінокислоти.

Наїб. поширення для визначення N-кінцевих залишків знаходить дансільний метод. Його перша стадія -приєднання дансілхлорідом (1-діметіламінонафталін-5-сульфохлоридів) до непротонірованнойаминогруппе з утворенням дансілпептіда (ДНС-пептиду). Потім останній гидролизуют 5,7 н. розчином НС1 при 105 ° С, в результаті чого звільняється N-кінцеваДНС-амінокислота, к-раю має інтенсивної флуоресценції в УФ-області спектра- для її ідентифікації досить 0,1-0,5 нмоль в-ва.

Для визначення С-кінцевих залишків найчастіше використовують ферментативний гідроліз Карбоксипептидаза. к-які специфічно розщеплюють пептидні зв`язки. утворені С-кінцевими залишками. Оскільки після відщеплення кінцевих залишків фермент атакує послід. пептидні зв`язку. вимір швидкості відщеплення окремих амінокислот дозволяє аналізувати також і С-кінцеву амінокислотну послідовність.

Найважливіший етап у визначенні первинної структури білка - розщеплення макромолекули на пептидні фрагменти. Серед ферментативних методів розщеплення наиб. широко використовується гідроліз трипсином. Трипсин володіє унікальною субстратной специфічністю. гидролизует виключно зв`язки, утворені карбоксильними групами осн. амінокислот - лізину і аргініну. Введення заступників в бічні ланцюга лізину або аргініну перешкоджає гідролізу по залишкам модифікується. амінокислот і дозволяє гідролізувати макромолекули вибірково тільки за залишками аргініну або лізину. Особливо часто використовується модифікація залишків лізину з послід. гідролізом білків по залишках аргініну. Модифікуючі агенти - ангідриди дикарбонових к-т (бурштинової, малеиновой і цітраконовой). З ін. Протеолітіч. ферментів широко застосовується протеаза з Staphylococcus aureus (гідролізує зв`язки, утворені карбоксильними групами залишків глутамінової к-ти, а в деяких випадках і залишків аспарагінової к-ти), а також хімотрипсин і термолізін. Останні ферменти мають більш широкої специфічністю. Хімотрипсин каталізує гідроліз пептидних зв`язків. утворених карбоксильними групами ароматичних. амінокислот - тирозину. фенілаланіну і триптофану. З меншою швидкістю гідролізуються зв`язку лейцину. метіоніну і гістидину. Термолізін переважно. розщеплює зв`язку, утворені аминогруппой залишків з гідрофобною бічним ланцюгом (ізолейцин. лейцин. валін. фенілаланін. тирозин. триптофан).

З хімічних методів розщеплення білків найбільш специфічний і найчастіше вживаний -бромціановое розщеплення по залишках метіоніну (вихід 90-100%):

Для розщеплення білків по карбонільної групі залишку триптофану використовують N-бромсукцинімід або більш селективний 2- (2-нітрофенілсульфеніл) -3-метил-3-броміндол (BNPS-скатол) (вихід Ю-50%):

Гидроксиламин розщеплює пептидні зв`язки між залишками аспарагина і гліцину. При його взаємодій. з циклич. имид ангідроаспартілгліціна, спонтанно утвореній із аспарагінілгліціна, в лужному середовищі відбувається розщеплення пептидного ланцюга з утворенням суміші іаспартілгідроксаматов:

У ряді випадків для розщеплення білків використовується метод часткового кислотного гідролізу. наиб. чутливі до дії к-т аспартільние пептидні зв`язку і особливо зв`язок аспартам - пропив.

При виборі методів поділу пептидів враховують фіз.-хім. властивості, кількість і довжину молекул поділюваних з`єднань. Для первинного фракціонування сумішей коротких пептидів. містять до 15-20 амінокислотних залишків, в більшості випадків використовують іонообмінну хроматографію на катіоніти. Подальший поділ і очищення проводять за допомогою хроматографії і електрофорезу на папері або пластинках з тонким шаром целюлози або силікагелю.

Осн. складність при фракціонуванні молекул великих пептидів (більше 20 амінокислотних залишків) - їх св-во злипатися в водних розчинах один з одним з утворенням високомол. агрегатів, що не піддаються поділу. Для запобігання агрегації в буферні розчини вводять сечовину (до 8 М), гуанідінійхлорід (до 6 М) або детергенти (додецилсульфат Na) - поділ часто проводять за допомогою гель-проникаючої хроматографії та іонообмінної хроматографії. Ефективний метод поділу - рідинна хроматографія високого дозволу на носіях з оберненою фазою. Для селективного виділення пептидів. несучих хімічно активні угруповання, м. б. використана хемоспеціфіч. (Ковалентний) хроматографія. заснована на утворенні ковалентного зв`язку пептиду з носієм. Напр. для виділення цістеінсодержащіх пептидів використовують р-цію тиол-дисульфидного обміну, за допомогою к-рій пептиди через дисульфідних місток приєднуються до модифікованого 2,2 `діпіріділдісульфідом носію. Ковалентно пов`язані з носієм цістеінсодержащіе пептиди м. Б. легко елюіровать при послід. обробці меркаптоетанолом.

Осн. метод дослідження амінокислотноїпослідовності пептидів і білків - хім. деградація за допомогою фенілізотіоціаната. Цей метод дозволяє послідовно отщеплять N-кінцеві амінокислотні залишки у вигляді фенілтіогідантоінов, к-які абсорбують світло в УФ-області з максимумом поглинання 265-270 нм. Для їх ідентифікації наиб. часто використовують тонкошарову хроматографію. рідинну хроматографію високого тиску. а також мас-спектрометрії. Широке застосування знайшов також метод, що поєднує послідовну деградацію пептиду по Едману (див. Едмана деградація) з аналізом N-кінцевих амінокислотних залишків у вигляді їх дансільних похідних. Гідність методу -його висока чутливість.

Для безпосереднього аналізу первинної структури білків зазвичай використовують секвенатор - прилад, к-рий з високою ефективністю здійснює послідовне авто-Матіч. відщеплення N-кінцевих амінокислотних залишків шляхом деградації білків за методом Едмана. Все р-ції проводяться в цилиндрич. скляному стаканчику, що обертається з постійною швидкістю в атмосфері інертного газу (рис. 4). Зразок білка розподіляється на стінках стаканчика у вигляді тонкої плівки. Оптимізація процесу і ретельне очищення реагентів і розчинників дозволили підняти загальний вихід реакції до 95% і вище. Найкращі об`єкти для секвенатор - білки і пептиди. містять в своєму складі від 60 до 200 амінокислотних остатков- для таких з`єднань зазвичай вдається визначати послідовність 30-35 (в ряді випадків 40-50) залишків. Для аналізу коротких пептидів більш ефективний підхід, що полягає в їх ковалентном приєднання до нерозчинних носію. Цей принцип покладено в основу твердофазного секвенатор, де реакц. "Посудиною" служить хроматографіч. колонка, з носієм к-рій до валентно пов`язаний досліджуваний пептид. Через колонку послідовно пропускають реагенти і р-Рітель. Носіями найчастіше служать полістирол і пористе скло. У кач-ве функц. групи, що реагує з пептидом. зазвичай використовується аліфатіч. або ароматичних. аминогруппа. Для приєднання до носія пептидів. утворюються в результаті бромціанового розщеплення, використовують високу реакц. здатність С-кінцевого лактона гомосеріна. Лізінсодержащіе пептиди м. Б. приєднані за рахунокаміногрупи шляхом конденсації з n-фенілендіізотіоціанатом. Решта пептиди приєднують по С-кінцевий карбоксильною групі карбодіімідним методом. Третє покоління приладів - газофазних секвенатори, в яких брало зразок наноситься на невеликий (діаметр ок. 5 мм) диск з пористого скляного волокна. а все реагенти подаються в газовій фазі. Таким способом аналізують Мікрокількості в-ва ( lt; 100 пкмоль).

Мал. 4. Схема реакційної камери секвенатор.

При визначенні амінокислотноїпослідовності пептидів знаходить застосування також мас-спектрометрії. У цьому випадку використовується здатність іонізуючого. молекул пептидів розпадатися по т. зв. амінокислотним типу фрагментації, що полягає в розриві СО-NH або СО зв`язків:

Ідентифікація в мас-спектрі піків, відповідних фрагментами А₁. А_п або а₁. а_п. дає інформацію про будову пептиду.

Наїб. складні проблеми виникають при вивченні первинної структури мембранних білків, а також білків, що виділяються в мізерно малих кол-вах або мають велику мовляв. масу (gt; 100000). Ряд цих проблем вирішено завдяки розробці швидких і ефективних методів аналізу нуклеотидної послідовності ДНК. Оскільки первинна структура будь-якого білка закодована в нуклеотидної послідовності відповідного їй ділянки ДНК. то визначення останньої дозволяє за допомогою генетичної. коду автоматично встановлювати і відповідну амінокислотну послідовність. При цьому виявилося особливо ефективним паралельне вивчення первинних структур білків і ДНК. Такий підхід різко прискорює проведення досліджень і значно підвищує достовірність результатів.

Методи вивчення просторової структури. При вивченні просторів. структури білків існує два принципових підходи: дослідження в розчині і в кристалічних. стані. Осн. метод, що дає безпосередню інформацію про просторів. розташуванні атомів в молекулі білка, - рентгеноструктурний аналіз. Він застосовується лише для добре кристалізуються білків. При цьому поряд з кристалом нативного білка необхідно отримувати похідні, що містять важкі атоми. к-які були б ізоморфними вихідного білку, тобто давали б подібні кристалічної. структури. Важкий атом вводиться в молекулу білка при "вимочування" кристала у відповідному розчині або в процесі кристалізації. Іноді використовують хім. модифікацію білка. напр. n-хлормеркурійбензоатом по SH-групам.

Інтерпретація карт електронної щільності молекули значно полегшується при знанні амінокислотноїпослідовності. Однак далеко не кожен білок вдається отримати в кристалічних. стані. Необхідна умова кристалізації - збереження нативної конформації. к-раю часто реалізується лише в умовах, наближених до фізіологічних. Зокрема, білки, що входять до складу нуклеопротеїдних комплексів (рибосома. Віруси), добре кристалізуються тільки в складі таких комплексів. За допомогою звичайного рентгенівського випромінювання проводити аналіз таких гігантських утворень складно. У цих випадках використовують синхротронне рентгенівське випромінювання, інтенсивність догрого може бути на два порядки вище. Внаслідок цього різко скорочується час експерименту по реєстрації дифракції. відображень, а також знижується кількість досліджуваного в-ва. Ряд мембранних білків кристалізується в умовах нативного ліпідного оточення з утворенням т. Зв. "Двомірних" кристалів. що представляють собою регулярно упаковані молекули білків в біслойной лііідной мембрані. При вивченні двомірних кристалів використовують електронну мікроскопію і Електронографи.

У мн. випадках хороші результати отримують, застосовуючи нейтронографії. Нейтрони. маючи низьку енергію, на відміну від рентгенівських променів не руйнують кристали білків, в результаті чого можна отримати повний набір дифракції. даних від одного кристала. З використанням цього методу вдається локалізувати в структурі білка окремі атоми водню. а також розташування молекул кристалізації. води.

У загальному випадку конформація білка в кристалі може відрізнятися (зазвичай досить незначно) від конформації в розчині. Тому поряд з дослідженням кристалів проводять вивчення білка і в його прир. середовищі. Існує набір методів дослідження просторів. структури білка в розчині. наиб. часто використовувані - оптич. методи (УФ, ІЧ та Раман-спектроскопія, круговий дихроизм. флуоресценція), ЯМР і ЕПР. Жодним із цих методів окремо, як правило, неможливо визначити конформацию білка, тоді як їх комбінація в ряді випадків дає інформацію, к-раю порівнянна за цінністю з рентгеноструктурньїм аналізом.

Мал. 5. Розташування молекули бактериородопсина в пурпурової мембрані. Ділянки поліпептидного ланцюга, доступні для йодування лактопероксідаза-L, протеолізу папаїном-Р, химотрипсином-Ch і карбоксипептидази А - СРА. А-антигенні детермінанти.

Оптична. методи дозволяють стежити за змінами конформації білка в процесі функціонування або при зміні навколишніх умов. Комбінація цих методів дає інформацію про відносить. утриманні в білку елементів вторинної структури, про розташування залишків триптофану щодо пов-сті білкової глобули і про конфігурацію зв`язків С-S-S-С в дисульфідних містках.

Пряму інформацію про просторів. будову білків в розчині дає метод ЯМР. Суч. методики ЯМР-спектроскопії дозволяють проводити практично повне віднесення сигналів в спектрах пептидів і невеликих білків (з мовляв. м. до 10.000) до певних ядер в молекулі. Використання гомоядерних (1 Н-1 H) і гетероядерних (* Н 13 C) констант спін-спінового взаємодій. дає можливість визначати торсіонні кути і осн. поліпептидного ланцюга і торсіонний кут х `бічних ланцюгів амінокислотних залишків. За допомогою ядерного ефекту Оверхаузера, зсувних і розширюють реагентів (іони парамагн. Металів. Спінові мітки) вимірюють відстані між окремими ядрами молекули. Т. обр. для пептидів і невеликих білків вдається визначити просторів. структуру з дозволом до 0,3-0,4 нм. Безсумнівна перевага ЯМР-спектроскопії - можливість отримувати інформацію про динаміку просторів. структури молекули білка.

Модифікація білка реагентами. несучими своб. радикал (спінова мітка) або флуоресцентну угруповання, дозволяє судити про хімічний. оточенні модифікується групи, а при наявності в білку двох таких міток - виміряти відстань між ними.

Теоретично можливо передбачати в загальному вигляді просторів. будову білка, виходячи з його амінокислотної послідовності. Такого роду розрахунки проводять за допомогою ЕОМ на підставі закономірностей, виведених в результаті статистич. обробки даних для білків з встановленої просторів. структурою. У ряді випадків розрахункові методи дають задовільні результати, к-які допомагають інтерпретувати дані, отримані ін. Методами.

При дослідженні просторів. структури білка часто використовують обмежений протеоліз. проводиться в м`яких неденатурірующіх умовах, в яких брало гідролізуються виключно пептидні зв`язку. що знаходяться на пов-сті глобули білка. Таким шляхом отримують інформацію про доменної структурі білка. У разі мембранних білків цим методом вдається розрізнити ділянки поліпептидного ланцюга, розташовані всередині мембрани і на її пов-сті (рис. 5). Аналогічну за характером, але значно більш детальну інформацію отримують при вивченні взаємодій. білків і їх окремих фрагментів з антитілами.

Синтез. Біосинтез білків відбувається в результаті трансляції в субклітинних частинках - рибосомах. що представляють собою складний рібонуклеопротєїдних комплекс. Інформація про первинну структуру білка "зберігається" у відповідних генах - ділянках ДНК - у вигляді послідовності нуклеотидів. У процесі транскрипції ця інформація за допомогою ферменту - ДНК-залежною РНК-полімерази - передається на матричну рибонуклеїнової к-ту, к-раю, з`єднуючись з рибосомою. служить матрицею для синтезу білка. Вихідні з рибосоми синтезовані поліпептидні ланцюги, мимовільно згортаючись, беруть властиву даному білку конформацію. а також піддаються модифікації завдяки р-ціям разл. функціональних груп амінокислотних залишків і розщеплення пептидних зв`язків (див. Модифікація білків).

Хім. синтез широко застосовують для отримання пептидів. в т.ч. біологічно активних гормонів і їх різноманітних аналогів, які використовуються для вивчення взаємозв`язку структури і біол. функції, а також пептидів. несучих антигенні детермінанти разл. білків і застосовуваних для приготування відповідних вакцин. Перші хім. синтези білків в 60-і рр. (Інсуліну вівці і рибонуклеази SX здійснені в розчині за допомогою тих же методів, к-які використовують при синтезі пептидів. Були пов`язані з надзвичайно великими складнощами. У кожному разі потрібно провести сотні хім. Р-ций і остаточний вихід білків був дуже низький (менше 0,1%), в результаті чого отримані препарати не вдалося очистити. Пізніше були синтезовані нек-риє хімічно чисті білки, зокрема інсулін людини (П. Зібер і ін.) і нейротоксин II з ядра середньоазіатської кобри (В. Т . Іванов). Однак до сих пір хім. синтез білків представляють вельми складну проблему і має скоріше теоретич. чим практич. значення. Більш перспективні методи генетичної інженерії. к-які дозволяють налагодити пром. отримання практично важливих білків і пептидів.

Відео: Урок "Хімічні властивості білків"

Значення білків в харчуванні. Білки-необхідна складова частина продуктів харчування. Проблема харчового білка стоїть дуже гостро. За даними Міжнародної організації з продовольства і с. х-ву при ООН більше половини людства не отримує з їжею необхідної кількості білків. Недолік білків в їжі викликає важке захворювання - квашиоркор.

В процесі травлення білки піддаються гідролізу до амінокислот. к-які і всмоктуються в кров. Харч цінність білків залежить від їх амінокислотного складу, змісту в них т. Зв. незамінних амінокислот. не синтезуються в організмі (для людини незамінні триптофан. лейцин. изолейцин. валін. треонин. лізин. метіонін і фенілаланін). У живильному відношенні ростить. білки менш цінні. ніж тварини-вони біднішими лізин. метионином і триптофан. важче перетравлюються. Один із шляхів вирішення проблеми - додавання в ростить. їжу синтетичні. амінокислот. Поряд з цим виводять нові сорти рослин, що містять гени. відповідальні за синтез відсутніх амінокислот. Перспективно використання для цього методів генетичної. інженерії. Надзвичайно важливе значення має широке впровадження пром. мікробіологічного синтезу. напр. вирощування дріжджів на гідролізним етиловому спирті. прир. газі або нафти. Отримувані при цьому білково-вітамінні концентрати (БВК) використовують в якості добавок до корму с.-г. тварин. Дослідження радянських мікробіологів і технологів (Г. К. Скрябін та ін.) Послужили основою для виробництва БВК в СРСР у великих масштабах.

Відео: Урок біології №30. Білки. Будова і функції

===
Ісп. література для статті «БІЛКИ». Бейлі Дж. Методи хімії білків, пров. з англ. М. 1965 Нові методи аналізу амінокислот. пептидів і білків, пров. з англ. М. 1974- Девені Т. Гергей Я. Амінокислоти. пептиди і білки, пров. з англ. М. 1976- Ш а м ін А. Н. Історія хімії білка, М. 1977- У айт А. [и др.], Основи біохімії. т. 1-3, пров. з англ. М. 1981- Льоні Нджеру А. Основи біохімії. т. 1-3, пров. з англ. М. 1975- Я кубку Х.-Д. Ешкайт X. Амінокислоти. пептиди. білки, пров. з нім. М 1985- Advances in protein chemistry, v. 1-33, N.Y. 1944-79- Methods in enzymology, v. 11. ed. by S. P. Cofowick, N.O. Kaplan, N.Y.-L, 1967- той же, v. 25, pt B, ed. by C.H.W. Hirs, S. N. TimashefT, N.Y.-L. 1972- Protein sequence determination. A sourcebook of methods and techniques, ed. by S. B. Needleman, 2 ed. В. 1975- The proteins, ed. by H. Neurath, R.L. Hill, 3 ed. 1-4, N. Y .- [a.o.], 1975-79- Methods in protein sequence analysis, ed. by M. Elzinga. Clifton, 1982. Ю. А. Овчинников.