Апоптоз сперматозоїдів: клінічне значення

Відео: Навіщо наші клітини постійно вмирають?

Апоптоз сперматозоїдів: клінічне значення
Стрелко Г. В.,
Бутенко Ю. Г.,
Марцінко О. Б.
Клініка генетики репродукції «ВІКТОРІЯ»
г. Киев, 2009 г.
Апоптоз, або запрограмована загибель клітини, являє собою процес, за допомогою якого внутрішні або зовнішні чинники, активуючи генетичну програму, призводять до загибелі клітини.
Апоптоз - це біохімічно специфічний тип загибелі клітини, який характеризується активацією нелізосомних ендогенних ендонуклеаз, які розщеплюють ядерну ДНК на маленькі фрагменти.
Біологічне значення апоптозу
• Видалення дефектних клітин організму.
• Підтримка гомеостазу.
• Контроль розміру органів.
• Розвиток ембріона.
З усіх формуються сперматозоїдів більше 75% зупиняються в розвитку завдяки апоптозу. Сперматозоїди, в яких був запущений цей механізм, але не був до конця завершений (неповний апоптоз, або абортивний апоптоз), можуть мати порушення цілісності ДНК (Singh N.P. 1999 Sakkas D. 2003)
Вплив на фертильність
• У безплідних чоловіків відсоток сперматозоїдів з порушенням цілісності ДНК 25 - 30% і більше (Spano M. 2000)
• У фертильних чоловіків - до 10 - 13% (Ahmadi A. 1999)
• Була знайдена кореляція між спонтанним перериванням вагітності і збільшенням відсотка сперматозоїдів з порушенням цілісності ДНК (Carrel D.T. 2003)
Поріг - ступінь фрагментації більше 30%
При ступеня фрагментації більше 30% знижується ймовірність настання вагітності до 1%. (Evenson et al., 1999 Larson et al. 2000).
виявлення
1. Чоловік ф-р 30%
2. Порушення овуляції 25%
3. Трубний фактор 20%
4. Безпліддя неясного генезу 25%
5. Ендометріоз 5%
6. еякуляторного дисфункція 5%
7. Шийного фактор 3%
8. Анатомічні аномалії матки lt; 1
15% пар мають більше 1 причини безпліддя
фрагментація ДНК
Клінічні прояви: безпліддя в шлюбі неясної етіології (Evenson et al., 1999 Larson et al. 2000), с / а, низька якість ембріонів, зниження частоти настання вагітності в програмах ДРТ (Genesca et al, 1992 Parinaud et al, 1993 - Twigg et al, 1998 Evenson et al, 1999).
причини апоптозу
зовнішні
1. Агресивні хімічні середовища
2. Іонізуюче випромінювання
3. Зараження вірусами
4. Локальна гіпертермія (пр. Варикоцеле)
5. Куріння
6. Екологічна обстановка
внутрішні
1. Генетичний апарат
технологія дослідження
• Основа технології-відмітний відповідь, ядер сперматозоїдів з фрагментованою ДНК у порівнянні з іншими сперматозоїдами.
• Контрольована денатурація ДНК, супроводжується видаленням ядерних білків.
• Петлі ДНК розширюються, формуючи ореол дисперсії хроматину.
• Ядро сперматозоїдів з фрагментованою ДНК не розвиває ореол дисперсії або ореол мінімальний.
ознаки апоптозу
• Зміни клітинної мембрани.
• Розпад клітинного ядра.
• Ущільнення хроматину.
• Фрагментація ДНК.
• Фрагментація клітин.
Критерії оцінки ступеня фрагментації ДНК сперматозоїдів
F - сперматозоїд з фрагментованою ДНК
N - нормальний сперматозоїд
Критерії оцінки ступеня фрагментації ДНК сперматозоїдів
Сперматозоїди БЕЗ ФРАГМЕНТАЦІЇ ДНК
• Сперматозоїди з великим ореолом, де товщина ореолу дорівнює, або більше діаметра ядра.
• Сперматозоїди з ореолом середнього розміру, де товщина ореолу повинна бути більше 1/3 діаметра ядра.
Сперматозоїди з фрагментацією ДНК
• Сперматозоїди з маленьким ореолом: товщина ореолу дорівнює або менше, ніж 1/3 діаметра ядра.
• Сперматозоїди без ореолу.
Візуалізацію ядер сперматозоїдів виробляли:
• На мікроскопі Zeiss Axio Imager M-1 з використанням иммерсионного об`єктива флуоресцентного мікроскопа при збільшенні х 100
• Підрахунок - 500 сперматозоїдів в досліджуваному зразку
Мета роботи
Виявити ступінь фрагментації ДНК в сперматозоїдах різних зразків еякуляту а також взаємозв`язок з ембріологічного показниками: запліднення, дроблення, здатність до формування бластоцист, настання вагітності.
матеріали та методи
В аналіз увійшли 32 зразки еякуляту пацієнтів після невдалих програм ДРТ (ICSI)
Невдалі спроби ICSI:
• 81,3% - збільшений ( gt; 30%) відсоток спермальної апоптозу (n = 26)
• 18,7% - нормальний відсоток спермальної апоптозу (n = 6)
Окремі показники спермограми чоловіків з різним рівнем фрагментації ДНК сперматозоїдів
№ Досліджуваний показник? рівень фр. ДНК N рівень фр. ДНК
1 Об`єм еякуляту (мл) 2,4 2,2
2 Концентрація (млн. / Мл) 8,1 12,5
3 Рухливість кат. А (%) 4,5 11,3
4 Рухливість кат. А + В (%) 19,2 23,3
5 Нормальна морфологія (%) 28,5 26,5
характеристика груп
№ Досліджуваний показник? рівень фр. ДНК N рівень фр. ДНК
1 Середній вік жінок пацієнтів (років) 29,2 28,9
2 Середній вік пацієнтів (років) 33,1 31,8
3 Середній рівень ФСГ дружин 5,8 5,3
4 Тривалість стимуляції (днів) 9,8 9,4
5 Доза гонадотропінів (амп.) 35,1 35,7
Ембріологічні показники при різних рівнях фрагментації ДНК сперматозоїдів
№ Досліджуваний показник? рівень фр. ДНК N рівень фр. ДНК
1 Середня к-ть ооцитів на пункцію 12,3 16,2
2 Відсоток запліднення 73 71
3 Відсоток дроблення 83,5 92
4 Відсоток ембріонів категорії А і В на з-ю добу культивування 34,6 58,5
5 Відсоток виходу бластоцист 25,1 45,3
Фрагментація ДНК сперматозоїдів виявлялася:
• Зниження активної рухливості сперматозоїдів
• Зниження відсотка ембріонів хорошої якості (категорія А + В)
• Зниження відсотка виходу бластоцист
Вплив антиоксидантної терапії на коефіцієнт спермальної апоптозу
медикаментозна терапія
• Вітаміни гр. С, Е, фолієва кислота, цинк
• Проксід-плюс®
Тривалість - 3 місяці
Клінічна група - пацієнти після невдалих програм екстракорпорального запліднення (ICSI), у яких був виявлено? ? спермальної апоптозу
результати
• Зниження коефіцієнта спермальної апоптозу зазначалося у всіх пацієнтів, але у 24% в незначній мірі (на 2 - 7%)
• Середній відсоток сперматозоїдів з фрагментованою ДНК до лікування - 67,4%
• Середній відсоток сперматозоїдів з фрагментованою ДНК після лікування - 44,9%
Зміни в спермограмме після антиоксидантної терапії
№ Досліджуваний показник До лікування Після лікування
1 Об`єм еякуляту (мл) 2,5 2,2
2 Концентрація (млн. / Мл) 11,5 14,9
3 Рухливість кат. А (%) 10,6 14,1
4 Рухливість кат. А + В (%) 18,3 21,1
5 Нормальна морфологія (%) 24,1 35,1
результати
• Пацієнт №1: 37 років, тривалість безпліддя 12років, 4 спроби ІКСІ, низький відсоток запліднення при ІКСІ. В останній - використання яйцеклітин подружжя і донора. Ембріологічна картина ідентична. Рівень фрагментації ДНК сперматозоїдів 87%.
• Пацієнт №2: 28 років, тривалість безпліддя 5 років, 1 спроба ІКСІ - невдача. Апоптоз - 49%
• Після проведеної терапії рівень фрагментації ДНК сперматозоїдів 27%. Повторна спроба - вагітність (гетерозиготна двійня).
• Пацієнт №4: 37 років, тривалість безпліддя 5 років, безпліддя неясного генезу (нормальні показники спермограми, прохідні маткові труби, овуляторні цикли). Вироблено 4 програми ІСМ. Рівень фрагментації ДНК сперматозоїдів 67%.
Підготовка до програми ЕКЗ при Виявлення фрагментації ДНК
• Виключення негативних впливів зовнішнього середовища (куріння, алкоголь, перегрівання і т. П.)?
• Антиоксидантна терапія 3 міс.
• Лікування варикоцеле
• Протизапальна терапія
• Застосування мікроелементів (Zn)?
висновок
• Визначення фрагментації ДНК сперматозоїдів є важливим доповненням до стандартного обстеження
• Показання - множинні невдалі спроби ЕКЗ - ICSI, незадовільні ембріологічні показники в програмах ЕКЗ - ICSI, безпліддя неясного генезу
• Отримання стійкої ремісії причинного патології, адекватна підготовка - запорука успішної програми ЕКО - ICSI