Мікроскопічна техніка

Відео: відео вправу мікрокосмічна орбіта

Мікроскопічна техніка = gt; Мікроскопічні методи дослідження

мікроскопічна техніка

мікроскопічна техніка - комплекс методів і засобів для отримання збільшеного зображення об`єктів, невидимих неозброєним оком.

Мікроскопічні методи дослідження

Мікроскопічні методи дослідження - способи вивчення різних об`єктів за допомогою мікроскопа. У біології та медицині ці методи дозволяють вивчати будову мікроскопічних об`єктів, розміри яких лежать за межами роздільної здатності ока людини. Основу М.м.і. становить світлова та електронна мікроскопія. У практичній і науковій діяльності лікарі різних спеціальностей - вірусологи, мікробіологи, цитологи, морфологи, гематологи і ін. Крім звичайної світлової мікроскопії використовують фазово-контрастну, интерференционную, люмінесцентну, поляризаційну, стереоскопічну, ультрафіолетову, інфрачервону мікроскопію. В основі цих методів лежать різні властивості світла. При електронній мікроскопії зображення об`єктів дослідження виникає за рахунок спрямованого потоку електронів.

Відео: Приготування мазка бактеріальної культури

Для світлової мікроскопії і заснованих на ній інших М.м.і. визначальне значення крім роздільної здатності Мікроскопа має характер і спрямованість світлового променя, а також особливості досліджуваного об`єкта, який може бути прозорим і непрозорим. Залежно від властивостей об`єкта змінюються фізичні властивості світла - його колір і яскравість, пов`язані з довжиною і амплітудою хвилі, фаза, площину і напрям поширення хвилі. На використанні цих властивостей світла і будуються різні М.м.і. Для світлової мікроскопії біологічні об`єкти зазвичай забарвлюють з метою виявлення тих чи інших їх властивостей (рис. 1). При цьому тканини повинні бути фіксовані, тому що забарвлення виявляє певні структури тільки убитих клітин. У живій клітині барвник відокремлюється в цитоплазмі у вигляді вакуолі і не фарбує її структури. Однак в світловому мікроскопі можна вивчати і живі біологічні об`єкти за допомогою методу вітальної мікроскопії. У цьому випадку застосовують темнопольний конденсор, який вбудовують в мікроскоп.

Для дослідження живих і нефарбованих біологічних об`єктів використовують також фазово-контрастну мікроскопію. Вона заснована на дифракції променя світла в залежності від особливостей об`єкта випромінювання. При цьому змінюється довжина і фаза світлової хвилі. Об`єктив спеціального фазово-контрастного мікроскопа містить напівпрозору фазову пластинку. Живі мікроскопічні об`єкти або фіксовані, але не пофарбовані мікроорганізми і клітини через їх прозорості практично не змінюють амплітуду і колір проходить через них світлового променя. викликаючи лише зрушення фази його хвилі. Однак, пройшовши через досліджуваний об`єкт, промені світла відхиляються від напівпрозорої фазової пластинки. В результаті між променями, що пройшли через об`єкт, і променями світлового фону виникає різниця довжини хвилі. Якщо ця різниця становить не менше 1 /₄ довжини хвилі, то з`являється зоровий ефект, при якому темний об`єкт виразно видно на світлому тлі або навпаки в залежності від особливостей фазової пластинки.

Відео: Мантек Чіа - Мікрокосмічна Орбіта

Різновидом фазово-контрастної мікроскопії є амплітудно-контрастна, або аноптрального, мікроскопія, при якій застосовують об`єктив зі спеціальними пластинками, що змінюють тільки яскравість і колір фонового світла. В результаті розширюються можливості дослідження живих нефарбованих об`єктів. Фазовоконтрастна мікроскопія знаходить застосування в мікробіології та паразитології при дослідженні мікроорганізмів, найпростіших, клітин рослин і тварин-в гематології для підрахунку і визначення диференціювання клітин кісткового мозку і крові-а також при вивченні клітин культури тканин і т.п.

Інтерференційна мікроскопія вирішує ті ж завдання, що і фазово-контрастна. Але якщо остання дозволяє спостерігати лише контури об`єктів дослідження, то за допомогою інтерференційної мікроскопії можна вивчати деталі прозорого об`єкта і проводити їх кількісний аналіз. Це досягається завдяки роздвоєння променя світла в мікроскопі: один з променів проходить через частку об`єкта, що спостерігається, а інший повз неї. В окулярі мікроскопа обидва променя з`єднуються і інтерферують між собою. Виникає різниця фаз можна виміряти, визначивши т. О. масу різних клітинних структур. Послідовне вимірювання різниці фаз світла з відомими показниками заломлення дає можливість визначати товщину живих об`єктів і нефіксованих тканин, концентрацію в них води і сухої речовини, вміст білків і т.д. На підставі даних інтерференційної мікроскопії можна побічно судити про проникності мембран, активності ферментів, клітинному метаболізмі об`єктів дослідження.

Поляризаційна мікроскопія дозволяє вивчати об`єкти дослідження в світлі, утвореному двома променями, поляризованими у взаємно площинах, тобто в поляризованому світлі. Для цього використовують плівчасті поляроїди або призми Ніколя, які поміщають в мікроскопі між джерелом світла і препаратом. Поляризація змінюється при проходженні (або відображенні) променів світла через різні структурні компоненти клітин і тканин, властивості яких неоднорідні. У так званих ізотропних структурах швидкість поширення поляризованого світла не залежить від площини поляризації, в анізотропних структурах швидкість його поширення змінюється в залежності від напрямку світла по поздовжній або поперечній осі об`єкта. Якщо показник заломлення світла вздовж структури більше, ніж в поперечному напрямку, виникає позитивне подвійне променезаломлення, при зворотних взаєминах - негативне подвійне променезаломлення. Багато біологічні об`єкти мають строгу молекулярну орієнтацію, є анізотропними та дають позитивне подвійне заломленням світла. Такими властивостями володіють міофібрили, вії миготливого епітелію, нейрофібрили, колагенові волокна і ін. Зіставлення характеру заломлення променів поляризованого світла і величини анізотропії об`єкту дозволяє судити про молекулярної організації його структури (рис. 2). Поляризаційна мікроскопія є одним з гістологічних методів дослідження (Гістологічні методи дослідження), способом мікробіологічної діагностики (Лабораторна діагностика), знаходить застосування в цитологічних дослідженнях (Цитологічнедослідження) і ін. При цьому в поляризованому світлі можна досліджувати як пофарбовані, так і нефарбовані і нефіксовані, так звані нативні препарати зрізів тканин.

Широке поширення має люмінесцентна мікроскопія. Вона заснована на властивості деяких речовин давати світіння - люмінесценцію в УФ-променях або в синьо-фіолетової частини спектра. Багато біологічні речовини, такі як прості білки, коферменти, деякі вітаміни і лікарські засоби, володіють власною (первинної) люмінесценцією. Інші речовини починають світитися тільки при додаванні до них спеціальних барвників - флюорохромів (вторинна люмінесценція). Флюорохромами можуть розподілятися в клітці дифузно або вибірково забарвлюють окремі клітинні структури або певні хімічні сполуки біологічного об`єкта. На цьому грунтується використання люмінесцентної мікроскопії при цитологічних і гістохімічних дослідженнях (див. Гистохимические методи дослідження). За допомогою імунофлюоресценції в люмінесцентному мікроскопі виявляють вірусні антигени і їх концентрацію в клітинах, ідентифікують віруси, визначають антигени і антитіла, гормони, різні продукти метаболізму і т.д. (Рис. 3). У зв`язку з цим люмінесцентну мікроскопію застосовують в лабораторній діагностиці таких інфекцій, як герпес, епідемічний паротит, вірусний гепатит, грип та ін. Використовують в експрес-діагностиці респіраторних вірусних інфекцій, досліджуючи відбитки зі слизової оболонки носа хворих, і при диференціальної діагностики різних інфекцій. У патоморфологии за допомогою люмінесцентної мікроскопії розпізнають злоякісні пухлини в гістологічних і цитологічних препаратах, визначають ділянки ішемії м`язи серця при ранніх термінах інфаркту міокарда, виявляють амілоїд в біоптатах тканин і т.д.

Ультрафіолетова мікроскопія заснована на здатності деяких речовин, що входять до складу живих клітин, мікроорганізмів або фіксованих, але не забарвлених, прозорих у видимому світлі тканин, поглинати УФ-випромінювання з певною довжиною хвиль (400-250 нм). Цією властивістю володіють високомолекулярні сполуки, такі як нуклеїнові кислоти, білки, ароматичні кислоти (тирозин, триптофан, метілаланіі), пуринові і пірамідіновие підстави і ін. За допомогою ультрафіолетової мікроскопії уточнюють локалізацію і кількість зазначених речовин, а в разі дослідження живих об`єктів - їх зміни в процесі життєдіяльності.

Інфрачервона мікроскопія дозволяє досліджувати непрозорі для видимого світла і УФ-випромінювання об`єкти шляхом поглинання їх структурами світла з довжиною хвилі 750-1200 нм. Для інфрачервоної мікроскопії не потрібно попередньої хімічної обробки препаратів. Цей вид М.м.і. найбільш часто використовують в зоології, антропології, інших галузях біології. У медицині інфрачервону мікроскопію застосовують в основному в нейроморфологии і офтальмології.

Для дослідження об`ємних об`єктів використовують стереоскопічну мікроскопію. Конструкція стереоскопічних мікроскопів дозволяє бачити об`єкт дослідження правим і лівим оком під різними кутами. Досліджують непрозорі об`єкти при відносно невеликому збільшенні (до 120 разів). Стереоскопічна мікроскопія знаходить застосування в мікрохірургії (Мікрохірургія), в патоморфології при спеціальному вивченні матеріалу біопсії, операційного та секційного матеріалу, в судово-медичних лабораторних дослідженнях.

Для вивчення на субклітинному і макромолекулярному рівнях структури клітин, тканин мікроорганізмів і вірусів використовують електронну мікроскопію. Цей М.м.і. дозволив перейти на якісно новий рівень вивчення матерії. Він знайшов широке застосування в морфології, мікробіології, вірусології, біохімії, онкології, генетики, імунології, Різке підвищення роздільної здатності електронного мікроскопа забезпечується потоком електронів, що проходять в вакуумі через електромагнітні поля, створювані електромагнітними лінзами. Електрони можуть проходити через структури досліджуваного об`єкта (трансмісійна електронна мікроскопія) або відбиватися від них (скануюча електронна мікроскопія), відхиляючись під різними кутами, в результаті чого виникає зображення на люмінесцентному екрані мікроскопа. При трансмісійної (просвічує) електронної мікроскопії отримують площинне зображення структур (рис. 4), при скануючої - об`ємне (рис. 5). Поєднання електронної мікроскопії з іншими методами, наприклад з радіоавтографія, гистохимическими, імунологічними методами дослідження (Імунологічні методи дослідження), дозволяє проводити електронно-радіоавтографіческіе, електронно-гістохімічні, електронно-імунологічні дослідження.

Електронна мікроскопія вимагає спеціальної підготовки об`єктів дослідження, зокрема хімічної або фізичної фіксації тканин і мікроорганізмів. Біопсійний матеріал і секційний матеріал після фіксації зневоднюють, заливають в епоксидні смоли, ріжуть скляними або алмазними ножами на спеціальних ультратомах, що дозволяють отримувати ультратонкі зрізи тканин товщиною 30-50 нм. Їх контрастують і потім вивчають в електронному мікроскопі. У сканирующем (растровому) електронному мікроскопі вивчають поверхню різних об`єктів, напиляя на них у вакуумній камері електронно-щільні речовини, і досліджують так звані репліки, що повторюють контури зразка. Див. Також Мікроскоп.

Мал. 2б). Мікропрепарат міокарда в поляризованому світлі при раптової смерті від гострої коронарної недостатності - виявляються ділянки, в яких відсутня характерна поперечнасмугастість кардіоміоцітов- 400.

Мал. 2а). Мікропрепарат міокарда в поляризованому світлі в нормі.

Відео: Як вчені створили аналог чорної діри на Землі Наука Наука і техніка

Мал. 3. Мікропрепарат перитонеального макрофагів в клітинній культурі, люмінесцентна мікроскопія.

Мал. 4. Електронограмма кардиомиоцита, отримана при трансмісійної (просвічує) електронної мікроскопії: чітко видно субклітинні структури-22000.

Мал. 1. Мікропрепарат міокарда при раптовій смерті від гострої коронарної недостатності: забарвлення по Лі дозволяє виявити контрактурной пересокращенія міофібрил (ділянки червоного кольору) - 250.